Livestock Research for Rural Development 28 (5) 2016 Guide for preparation of papers LRRD Newsletter

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Efecto de diferentes niveles de nitrato de calcio sobre la degradación de la materia seca y la producción de metano en una fermentación ruminal in vitro de pasto Kikuyo (Cenchrus clandestinus Hochst. Ex Chiov.)

R R Noguera, S L Posada y L Cardona

Universidad de Antioquia - UdeA, Facultad de Ciencias Agrarias. Grupo de Investigación en Ciencias Agrarias - GRICA.
Ciudadela de Robledo, Carrera 75 Nº 65·87, Medellín - Antioquia
ricnoguera@gmail.com

Resumen

El objetivo de este trabajo fue determinar el efecto de niveles crecientes de nitrato de calcio sobre la degradación de la materia seca y la producción de metano in vitro. Los tratamientos consistieron en la incubación de 500 mg de pasto Kikuyo con cuatro niveles de nitrato de calcio (CaNO3) : 0, 3, 6 y 9% con base en la materia seca incubada. Las variables evaluadas fueron producción acumulada de gases, degradación aparente de la materia seca, producción de ácidos grasos volátiles, producción de metano y concentración de nitrógeno amoniacal. El efecto de los nitratos sobre las variables evaluadas se determinó mediante un análisis de medidas repetidas en el tiempo, considerando un modelo mixto, donde los horarios de incubación y los niveles de nitrato fueron efectos fijos y los animales donadores de inóculo se describieron como un efecto aleatorio.

 

Con 24 horas de incubación, la adición del 6% de nitrato de calcio redujo en un 32% la producción total de gases de la fermentación, en un 17% la degradación de la materia seca y en un 49% la producción de metano con respecto al tratamiento sin nitrato. Las concentraciones de propionato butirato y acetato se redujeron al incrementar el porcentaje de nitrato en el ambiente de fermentación. En este experimento niveles de inclusión de nitrato de calcio superiores al 3% redujeron significativamente la degradación de la materia seca.

Palabras clave: gases de efecto invernadero, mitigación, nitritos, rumiantes



Effect of different levels of calcium nitrate on dry matter degradation and methane production in an in vitro rumen fermentation of Kikuyu grass

Abstract

The aim of this study was to determine the effect of increasing levels of calcium nitrate on the in vitro dry matter degradation of Kikuyu grass and on methane production. Treatments consisted of incubating 500 mg of Kikuyu grass (Cenchrus clandestinus Chiov Hochst Ex..) with four levels of calcium nitrate (CaNO3): 0, 3, 6 and 9% (dry matter basis). The variables analyzed were cumulative gas production, dry matter degradation, methane production and concentration of ammonia and volatile fatty acids. A repeated measures analysis was conducted considering a mixed model, where incubation times and nitrate levels were fixed effects and animal inoculum donors were described as a random effect. With 24 hours of incubation, the addition of 6% calcium nitrate reduced the total gas production (32%), dry matter degradation (17% ) and methane production (49%). Concentrations of butyrate, propionate and acetate decreased with increasing the nitrate in the fermentation médium. In this experiment, calcium nitrate above 3% significantly reduced the dry matter degradation.

Key words: greenhouse gases, mitigation strategies, nitrites, ruminants


Introducción

Los rumiantes producen cerca de 80 millones de toneladas de metano (CH4) anualmente, cantidad equivalente al 28% de las emisiones antropogénicas de este gas (Leng 2008). El CH4 es producido durante la degradación ruminal de carbohidratos y proteínas para producir hidrogeno (H2), dióxido de carbono (CO2), ácidos grasos volátiles (AGV) y biomasa microbiana.  Este proceso fermentativo resulta en una producción elevada de H2 que necesita ser removido para que el proceso de fermentación y el crecimiento microbiano continúe de manera eficiente  (Imming 1996).

 

Gran parte del H2 producido en el rumen es removido en forma de CH4 por las bacterias metanogénicas. Estas bacterias reducen el CO2 a CH4 con ayuda de agentes reductores como la nicotinamida adenina dinucleótido (NADH) (Beauchemin et al 2008). El CH4 resultante a partir de la metanogénesis representa una perdida energética para el animal (Johnson and Johnson, 1995) y se convierte en un problema ambiental por ser un gas con significativo efecto invernadero.

 

Aceptores de H2 diferentes al CO2 han sido propuestos como estrategia para disminuir la síntesis ruminal de CH4. Estas sustancias incluyen ácidos orgánicos como el fumarato, que a nivel ruminal es reducido a ácido succínico, proceso que consume iones de H2 en la vía de síntesis de propionato; los sulfatos que son reducidos y utilizados por bacterias sulfato reductoras como aceptores de electrones obteniendo como producto final sulfuro de hidrógeno (H2S) y finalmente, los nitratos, que pueden remplazar al CO2 como aceptor de electrones y generar productos reducidos (amonio) diferentes al CH4 (Leng, 2008). Sin embargo, la utilización de nitratos como fuente de nitrógeno en dietas para rumiantes es limitada, dado que en su proceso de reducción se forman nitritos, que al ser absorbidos a través del epitelio ruminal, pasan a sangre donde se unen a la hemoglobina y generan la condición conocida como metahemoglobinemia, que en algunos casos puede llegar a ser letal.

 

La dosis mínima letal de nitratos para rumiantes no puede ser fácilmente definida debido a que esta depende de variables como la composición de la dieta, consumo y método de administración (Alaboudi 1985). Las dosis tóxicas para rumiantes varían entre 198 y 998 mg de nitrato /kg de peso vivo (Leng 2008). Sin embrago,  los efectos negativos de los nitratos pueden ser reducidos a través de la adaptación gradual de los animales al consumo de esta fuente de nitrógeno y contribuir de esta manera a reducir las emisiones de gases de efecto invernadero.

 

El objetivo de este trabajo fue determinar el efecto de niveles crecientes de nitrato de calcio sobre la degradación de la materia seca y la producción de metano in vitro.


Materiales y métodos

Localización y tratamientos

 

El experimento se realizó en el laboratorio de nutrición animal NutriLab – GRICA, de la Universidad de Antioquia. Los tratamientos consistieron en la incubación de 500 mg de pasto Kikuyo (Cenchrus clandestinus Hochst. Ex Chiov.) con cuatro niveles de nitrato de calcio (CaNO3) : 0, 3, 6 y 9% con base en la materia seca incubada.

 

Análisis realizados sobre el forraje

 

Sobre la muestra de forraje fueron determinadas las concentraciones de cenizas por incineración completa en mufla a 550º C, proteína cruda (PC) (N x 6.25) siguiendo el método de Kjeldahl, materia seca (MS) por secado de la muestra en estufa de ventilación forzada  CITATION AOA90 \l 1034 (AOAC, 1990)  fibra detergente neutro (FDN) y fibra detergente ácido (FDA) de acuerdo con el método propuesto por Van Soest et al (1991).

 

Técnica in vitro de producción de gases (TPG)

 

Se utilizó la técnica in vitro de producción de gases como descrito por Posada y Noguera (2005). La muestra de forraje verde fue secada en horno y molida a través de criba de 1 mm. En frascos individuales con capacidad de 100 ml se pesaron 500 mg de forraje seco para su posterior incubación.  El inóculo ruminal se obtuvo de tres vacas Holstein canuladas, las cuales se manejan en un sistema de pastoreo rotacional con pasto Kikuyo  y se suplementaban con 1 kg de concentrado/día. Las muestras de digesta, tomadas directamente del rumen a las 0600 h de la mañana, se exprimieron y almacenaron en frascos térmicos a 39º C para su posterior transporte al laboratorio. En el laboratorio, el liquido ruminal de cada animal se filtró a través de cuatro capas de gasa, se sumergió en baño maría a 39º C y  continuamente se gaseó con CO2 para garantizar condiciones de anaerobiosis.

 

Con el propósito de mantener un adecuado valor de pH durante el proceso de fermentación, se preparó una solución como descrito por McDoougall (1948). En cada frasco de fermentación que contenía la muestra de forraje  y el correspondiente nivel de inclusión de CaNO3, se adicionaron 45 ml de solución tampón y 5 ml de líquido ruminal. Los frascos fueron gaseados con CO2, sellados con tapas de caucho e incubados en estufa de ventilación forzada a 39º C por un periodo de 48 horas.  A intervalos regulares, los frascos fueron agitados simulando la actividad ruminal.

 

Volumen de gas y análisis químico

 

La presión generada por la acumulación de gas en la parte superior de los frascos de fermentación se midió a las 6, 12, 24 y 48 horas después de la inoculación, con ayuda de un transductor de presión (Ashcroft 2089QG - Precision Digital Test Gauges, USA). Los datos de presión medidos en libras por pulgada cuadrada (PSI) fueron transformados en volumen (ml) (Posada, 2006). El volumen total de gas producido en cada horario de medición  se almacenó en bolsas plásticas con sellado hermético para su posterior análisis. Una muestra de 100 μl del gas almacenado se tomó con ayuda de una jeringa gas tight (Restek ®, USA) e inyectó en un cromatógrafo de gases Thermo Trace GC Ultra (Thermo Scientific, USA) equipado con una columna FAMEWAX (30 m x 0.32 mm x 0.25 μm) (Restek ®, USA) y un detector de ionización de llama (FID). Las temperaturas fueron 100º C en la columna, 250º C en el inyector y 200º C en el detector. El gas de arrastre fue helio (He) y su tasa de flujo fue de 25 ml/min.  La concentración de CH4 fue calculada por calibración externa, utilizando aliquotas de gas CH4 de composición garantizada (99.9% CH4) (Linde S.A, Medellín, Colombia) (Lopez y Newbold, 2007).  Los cromatogramas fueron integrados utilizando el software ChromQuest versión 5.0 (Thermo Scientific, USA).

 

Para acompañar el proceso de degradación del sustrato, frascos en los horarios 6, 12, 24 y 48 horas fueron retirados del proceso de incubación y filtrados utilizando crisoles de vidrio (porosidad 1, 100 – 160 μm). La degradación de la materia seca (MS) fue calculada por diferencia de peso entre el sustrato incubado y el residuo, en el respectivo horario de degradación y expresada como una proporción de la MS incubada. Una muestra (30 ml) del medio de incubación de cada frasco fue tomada y centrifugada (4000 rpm) por 20 minutos para cuantificar la concentración de ácidos grasos volátiles (AGV) (acético, propiónico y butírico) por cromatografía gaseosa siguiendo la metodología descrita por  Madrid et al (1999).

 

Análisis estadístico

 

Para determinar el efecto de los nitratos sobre las variables evaluadas se realizó un análisis de medidas repetidas en el tiempo, considerando un modelo mixto, donde los horarios de incubación y los niveles de nitrato fueron efectos fijos y los animales donadores de inóculo se describieron como un efecto aleatorio (Littell et al 1998). Las medias de tratamientos fueron comparadas con ayuda del procedimiento LSMEANS de SAS  CITATION SAS03 \l 1034 (SAS, 2003).


Resultados

La composición química del forraje evaluado se describe en la Tabla 1. Las concentraciones para los diferentes constituyentes nutricionales están dentro de los rangos habitualmente reportados para esta especie en la zona norte de Antioquia  y el altiplano cundiboyacence en Colombia (Correa et al 2008).

Tabla 1. Composición química pasto Kikuyo (Cenchrus clandestinus Hochst. Ex Chiov.) evaluado

Ítem

Concentración g/kg

Materia seca

160

Proteína cruda

200

Fibra detergente neutro

530

fibra detergente ácido

260

Hemicelulosa

270

Celulosa

207.8

Lignina

52.2

Calcio

3.2

Fósforo

4.3

Las variables, volumen de producción de gases de la fermentación (ml/g de MS incubada) y la degradación de la MS (% de la MS incubada) no fueron  influenciadas por el nivel de nitrato en las primeras seis horas de incubación (Tabla 2). Las primeras diferencias entre tratamientos se evidencian transcurridas 12 horas de incubación; claramente la adición de nitrato de calcio redujo la producción de gases (p<0.05) aproximadamente en un 36% con respecto al tratamiento sin nitrato. Con 24 y 48 horas de incubación la producción acumulada de gases fue equivalente (p>0.05) entre los tratamientos con 0 y 3% de nitrato y superiores a los registrados para los tratamientos con 6 y 9% de nitrato, indicando que niveles de inclusión superiores al 6% de nitrato de calcio afectaron significativamente el proceso fermentativo.

Tabla 2. Producción acumulada de gases in vitro y degradación aparente de la MS con diferentes niveles de nitrato a través del tiempo.

Nivel de Nitrato1 (%)

Tiempo de incubación (h)

Volumen de gas (ml)

Degradación de la MS (%)

0

6

23.8 a

23.4 a

3

6

18.8 a

23.5 a

6

6

18.3 a

22.0 a

9

6

23.7 a

19.7 a

0

12

62.3 a

35.1 a

3

12

42.4 b

30.6 ab

6

12

36.1 b

28.0 b

9

12

39.4 b

27.3 b

0

24

131.6 a

54.7 a

3

24

123.6 a

53.1 a

6

24

89.9 b

45.5 b

9

24

71.6 b

32.2 c

0

48

209.1 a

60.0 a

3

48

200.4 a

59.5 a

6

48

178.9 b

52.6 b

9

48

134.3 c

41.6 c

1 Letras minúsculas distintas en una misma columna indican diferencias estadísticas entre tratamientos para un mismo horario de incubación (p<0.05)

La degradación de la MS fue afectada por el nivel de inclusión de nitrato a partir de las 12 horas de incubación in vitro. En este horario, los porcentajes de degradación de los tratamientos con 6 y 9% de nitrato, presentaron una significativa reducción en su degradabilidad con respecto a los tratamientos con 0 y 3% de inclusión (p>0.05).  Con 24 y 48 horas de incubación, la menor degradación de la MS se registró en el tratamiento con 9% de nitrato, presentando una reducción del 30.7% en la degradación, con respecto al tratamiento con 0% de nitrato después de 48 horas de incubación.

 

Las concentraciones de AGV (mM/l) no difirieron entre tratamientos durante las primeras 6 horas de incubación in vitro (Tabla 3). Sin embargo, la producción acumulada de AGV después de 48 horas de iniciado el proceso de fermentación indica que la producción de acetato y butirato disminuye sustancialmente (p<0.05) a partir del 6% de inclusión de nitrato de calcio. El aumento en la participación del nitrato no tuvo efecto sobre la producción de propionato y la relación acetato : propionato, sin embargo se observó una tendencia a la reducción de estos parámetros con la mayor participación del nitrato.   

Tabla 3. Producción de ácidos grasos volátiles (AGV) (mM/l) en pasto Kikuyo incubado con niveles crecientes de nitrato de calcio (Cenchrus clandestinus Hochst. Ex Chiov.)

Tiempo
(h)

AGV

Nivel de inculsuión de nitrato de calcio, (%)1

0

3

6

9

ES2

6

Acetato

68.6

81.6

82.5

85.7

3.8

Propionato

32.2

36.5

35.9

34.2

1.0

Butirato

20.4

21.7

21.2

20.3

0.3

Total

121.2

139.8

139.6

140.2

4.7

A:P3

2.1

2.2

2.3

2.5

0.1

 

12

Acetato

109.1

100.6

70.2

79.4

9.0

Propionato

51.4 a

40.6 ab

32.4 b

38.1 ab

4.0

Butirato

25.6 a

20.9 b

17.9 b

21.2 b

1.6

Total

186.1

162.1

120.5

138.7

14.2

A:P

2.1

2.5

2.2

2.1

0.1

 

24

Acetato

129.8

129.0

139.7

97.8

9.1

Propionato

67 a

57.1 ab

54.3 ab

41.3 b

5.3

Butirato

28.8 a

25.4 ab

23.5 bc

17.8 c

2.3

Total

225.6

211.5

217.5

156.9

15.6

A:P

1.9

2.3

2.6

2.4

0.1

 

48

Acetato

176.3 a

184.2 a

138.4 ab

116.3 b

16.0

Propionato

64.3

65.7

58.5

51.9

3.1

Butirato

33.7 a

32.6 a

26.8 b

24.9 b

2.2

Total

274.3

282.5

223.7

193.1

21.2

A:P

2.7

2.8

2.4

2.2

0.1

1 letras minúsculas distintas en una misma fila indican diferencias estadísticas significativas entre tratamientos (p<0.05) para un mismo horario de incubación.
2 ES = error estándar
3 A:P = relación acetato : propionato

Diferencias en la producción de metano (CH4) solo fueron evidentes a partir de las 12 horas de incubación ruminal (Tabla 4). Claramente la adición de nitrato de calcio en concentraciones superiores al 3%, redujeron significativamente la producción de CH4 (p<0.05). Después de 48 horas de incubación la reducción en la producción de CH4 en los tratamientos con 6 y 9% de nitrato de calcio correspondió al 28.3 y 52.4%, cuando comparados con el tratamiento sin nitrato, respectivamente.

 

Las concentraciones de nitrógeno amoniacal en el ambiente de fermentación no variaron entre tratamientos a través del tiempo (p>0.05) (Tabla 4).

Tabla 4. Producción de metano y nitrógeno amoniacal del pasto Kikuyo (Cenchrus clandestinus Hochst. Ex Chiov.) incubado con niveles crecientes de nitrato de calcio

Tiempo,
horas

Nivel de inclusión de nitrato de calcio (%)

ES

0

3

6

9

Metano, ml/g MS incubada

6

1.6

1.1

1.1

1.4

0,1

12

4.9 a

1.8 b

1.3 b

1.0 b

0,9

24

9.1 a

10.3 a

3.9 b

1.9 c

2,0

48

13.1 a

10.5 b

8.4 c

4.3 d

1,9

Metano, ml/g MS degradada

6

15,2

10,5

11,3

15,7

0.5

12

24.4 a

13.0 b

10.3 b

7,8 b

1.2

24

36.9 a

42.9 a

18.9 bc

13.1 c

3.2

48

48.1 a

40.7 a

34.5 bc

22.9 c

4.3

Nitrógeno amoniacal, mg/dl

6

4.7

2.7

4.7

5.7

0.6

12

6.9

7.2

7.5

7.9

1.2

24

5.4 c

7.8 b

10.1 a

12.6 a

1.1

48

10.6 b

11.3 b

11.7 b

15.3 a

1.0

1 letras minúsculas distintas en una misma fila indican diferencias estadísticas significativas entre tratamientos (p<0.05) para un mismo horario de incubación.


Discusión

En los sistemas de fermentación in vitro, el volumen de los gases producidos durante el proceso fermentativo es proporcional a la cantidad de MS degradada. La adición de nitrato de calcio en niveles superiores al 3% redujo significativamente la producción total de gases y la degradación de la MS a partir de las 24 horas de incubación (Tabla 2).

 

La literatura es consistente al indicar que en sistemas de fermentación in vitro, la adición de nitratos reduce el volumen de gases producidos durante la fermentación (Ngoc Huyen et al 2010;  Inthapanya et al 2011; Binh Phuong et al 2011; Lin et al 2011; Mamvura et al 2014). Explicaciones a este respecto se centran en los efectos tóxicos de los nitratos sobre los microorganismos celulolíticos que pueden reducir la digestibilidad aparente de los forrajes y disminuir la producción de gases (Hall et al 1960). Por otra parte, Marais et al (1988) evaluando el efecto del nitrato y sus productos de reducción sobre el crecimiento y actividad microbiana en sistemas de fermentación in vitro con pasto Kikuyo  (Cenchrus clandestinus Hochst. Ex Chiov.) sostienen que la acumulación de nitritos durante la reducción del nitrato a amonio es la responsable de la menor digestibilidad del sustrato al diezmar las poblaciones de microorganismos celulolíticos y xilanolíticos.

 

En este sentido, Leng (2008) manifiesta que la suplementación con azufre o cisteína en dietas que contienen nitratos puede reducir la acumulación de nitritos en el rumen y contrarrestar su impacto sobre la degradación de la MS. Este mismo autor relata que en iguales condiciones el Kikuyo y el Ryegrass tienen equiparables contenidos de PC, pero los contenidos de metionina y cisteína del Kikuyo son 68 y 57% menores a los del Ryegrass. Esta condición podría explicar el hecho de que la reducción en la digestibilidad de la MS sea más drástica en el Kikuyo que en el Ryegrass cuando se adicionan nitratos en la dieta. Aparentemente, el metabolismo del nitrato inhibe la conversión del azufre orgánico e inorgánico en el rumen, reduciendo el pool de intermediarios de azufre requeridos por bacterias y hongos celulolíticos para su crecimiento y multiplicación (Gordon y Phillips 1998; Marais 1998). El menor numero de estas poblaciones sería el responsable de la reducción en la digestibilidad de la MS, sugiriendo que la suplementación con azufre es requerida cuando los animales sean suplementados con nitratos.     

 

Las concentraciones de propionato, butirato y acetato se redujeron significativamente al incrementar el porcentaje de nitrato en el ambiente de fermentación (Tabla 3). La disminución en las concentraciones de butirato y propionato a partir de las 12 horas de incubación indican que el nitrato fue rápidamente reducido en el medio, consumiendo el hidrógeno (H2) necesario para la formación de estos ácidos grasos (Li et al 2012). De acuerdo con Ungerfeld y Kohn (2006), la reducción del nitrato es termodinámicamente más favorable que la propiogénesis; siendo así, el nitrato compite con mayor eficiencia por el uso de los átomos de H2. Este hecho puede evidenciarse en la Tabla 4, donde las concentraciones de nitrógeno amoniacal aumentaron en función de la adición de nitrato al medio.

 

La producción de CH4 fue significativamente reducida con la adición de nitrato (Tabla 4). En condiciones anaerobias el nitrato es reducido a amonio y en este proceso  consume 8 hidrógenos, reduciendo así, la disponibilidad de electrones para la síntesis de CH4 (Leng, 2008).  La eficiencia en la captura de electrones por parte del nitrato radica en que el cambio de energía libre para la reducción de nitrato a amonio es de -254 kJ/mol de hidrógeno, en tanto que la energía libre para la formación de CH4 es de -16.9 kJ/mol de hidrógeno (Ungerfeld and Kohn 2006). En estas condiciones la producción de CH4 es inhibida hasta tanto todo el nitrato sea reducido a amonio.

 

Otra explicación para la reducción en la producción de CH4 en este experimento, radica en la reducción en la degradación de la MS. Menos MS fermentándose implica menor producción de gas, menor producción de AGV y menor producción de metano. Niveles de inclusión de nitrato superiores al 3% podrían tener efectos adversos sobre el consumo, la digestibilidad y la salud animal. Las reducciones en las tasas de degradación del alimento con la utilización de nitratos son asociadas a la acumulación de nitritos que inhiben el sistema transportador de electrones de algunas especies de microorganismos limitando la generación de ATP para su crecimiento (Marais et al 1988).

 

Reducciones significativas en la emisiones de CH4 con la adición de nitratos son ampliamente reportadas en la literatura. Estudios in vitro relatan disminuciones que varían entre el 42 y 85% (Guo et al 2009; Iv Sophea, 2010; Ngoc Huyen et al 2010; Lin et al 2011; Inthapanya et al 201; Mamvura et al 2014). La amplia variación en la reducción de las emisiones de CH4 obedece a la fuente y dosis de nitrato empleada en cada estudio. En este trabajo la reducción en la emisión de metano después de 24 horas de incubación fue de 49 y 64.5% para los tratamientos con 6 y 9% de nitrato, respectivamente (Tabla  4)


Conclusiones


Agradecimientos

Este trabajo hace parte del proyecto “Fortalecimiento de la producción de la cadena láctea del distrito Norte Antioqueño", contrato No. 2013AS180031, financiado con recursos del Sistema General de Regalías – SGR, el Comité para el Desarrollo de la Investigación CODI (Estratégia para la Sostenibilidad 2016 grupo GRICA) y COLCIENCIAS a través del proyecto “Evaluación in-vitro e in-vivo de diversas estrategias nutricionales para mitigar las emisiones de metano y su impacto productivo, reproductivo y económico en ganadería de leche especializada en el norte de Antioquia”.


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Received 7 February 2016; Accepted 25 March 2016; Published 1 May 2016

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